化学磷酸化试剂的应用
发布日期：2025-05-23 浏览次数：816
化学磷酸化试剂（Chemical Phosphorylation Reagent, CPR）是寡核苷酸合成领域的关键工具，主要用于在寡核苷酸5'-端引入磷酸基团，以满足基因克隆、适配体构建及连接子制备等需求。相较于传统的酶促磷酸化方法，CPR凭借其操作便捷、产率高、可直接在合成仪上使用等优势，逐渐成为主流选择。本文系统梳理CPR的作用机制、技术迭代、应用场景及代表性产品特性。
经典CPR（CAS No. 108783-02-4）通过二乙基磺酰基的β-消除反应生成磷酸基团（图1）。其优势在于成本低、适用性广，但存在显著局限性：
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不兼容DMT-ON纯化技术。这是因为在氨水脱保护过程中，无论是否存在DMT基团，磺乙基都会被消除。如果保留DMT基团用于DMT-ON纯化，它会与磺乙基一起被消除，产生5'-磷酸。
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脱保护条件相对苛刻，需要氨水中室温17小时或55°C 4小时才能使消除反应完全。
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不兼容标准的AMA脱保护条件。
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不适用于多磷酸的合成。
图1 CPR的β-消除机制
为克服经典CPR的缺陷，CPR II（CAS No. 171285-25-9）及其固态类似物Solid CPR II（CAS No. 202284-84-2）应运而生。
以Solid CPR II (CAS No.: 202284-84-2)为例，其消除反应机制如下：消除反应机制可分为两个阶段：首先，在温和条件下羟基发生质子脱除并伴随甲醛生成；随后消除反应迅速完成，最终形成5'-磷酸产物，历程详见图2。
值得注意的是，当羟基仍受DMT基团保护时，消除反应会被完全抑制，从而实现DMT-ON模式下的纯化操作。
待纯化寡核苷酸洗脱后，仅需在稀氨水溶液中室温处理15分钟，即可高效获得5'-磷酸化修饰的寡核苷酸。
图2 CPR II的消除机制
改良版CPR核心改进包括：
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与DMT-ON纯化技术兼容。这是改良版本的一个非常大的优势。当DMT基团存在时，消除反应被完全抑制。
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偶联效率与原始版本相同。
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脱保护条件更温和。当DMT基团被移除后，消除反应在非常温和的条件下即可发生。即使是最温和的条件也足以生成5'-磷酸，这对于RNA或敏感染料的脱保护非常有用。
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与标准脱保护条件兼容。
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Solid CPR II比CPR II在寡核苷酸合成条件下更稳定。
表1总结了三种主流CPR产品的关键参数以及相关特性对比：
表1：3种常见Chemical Phosphorylation Reagent
注：Solid CPR II凭借固态特性，在储存与合成过程中稳定性显著优于液态版本，尤其适用于高通量合成需求。
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芜湖华仁已实现CPR单体的稳定生产，长期稳定供应单体产品。为满足3’-磷酸的合成，可根据客户需求进行CPR固载定制。
表2：3种常见Chemical Phosphorylation Reagent物料信息
