5'-VP修饰Oligo合成：如何选择最优的脱保护条件？

在上一期《5'端VP修饰：提升siRNA基因Knockdown效率》中，我们详细探讨了(E)-乙烯基膦酸盐（VP）作为天然5'-单磷酸的理想替代物，如何通过抵抗内源性磷酸酶降解来显著提升siRNA的药效与持久度。同时，双POM保护的5'-(E)-BisPOM-VP亚磷酰胺也是目前兼具固相合成兼容性与稳定性的主流VP修饰单体。

在实际的Oligo合成与工艺放大过程中，如何安全、彻底地脱除POM保护基，同时精准控制杂质谱，是研发与工艺团队需要重点解决的问题。本文依据Alnylam Pharmaceuticals发表在Tetrahedron上的研究成果（O'Shea et al., Tetrahedron 2018, 74, 6182-6186），解析5'-(E)-BisPOM-VP脱保护过程中的杂质来源，并整理出经过验证的工艺建议。

一、传统脱保护条件面临的三类核心杂质挑战

在处理含有POM保护基的VP寡核苷酸时，如果直接套用普通Oligo脱保护方法，往往会引发三种难以避免的特征杂质风险。为了清晰理解整个脱保护反应的化学演进，研究人员首先系统梳理了固相结合POM-VP Oligo的脱保护路线。

图1：POM-VP寡核苷酸脱保护反应路线与工艺选择

图1详细梳理了固相结合的5'-POM-VP寡核苷酸在脱保护过程中的化学演变路径：（i）柱上经过5%哌啶或5%二乙胺（DEA）无水乙腈洗脱预处理；（ii）再用28-30%浓氨水在35°C（20h）或60°C（5h）下裂解脱保护。路线显示，柱上强碱预处理虽可脱除氰乙基，但哌啶会明显诱导5'-POM发生链断裂；直接氨解或添加适度亲核试剂则会影响粗品副反应的分流方向。

01哌啶预处理诱导的VP端N-1降解副产物

在标准DNA/RNA合成中，柱上“哌啶预处理-氨水裂解”两步法常用于脱除氰乙基保护基。然而，对于5'-POM-VP Oligo，5'-末端的POM保护基会在强碱性条件下引发链裂解反应，导致末端核苷酸丢失，产生约20%的带有5'-单磷酸的N-1结构副产物（分子量减少317）。

图2：哌啶预处理诱导ON-2发生5'-末端N-1链裂解

当5'-POM-VP 23-mer模型序列（ON-2）先经过哌啶预处理再用氨水脱保护时，LC-MS粗品图谱中出现了明显的副反应峰。结合图1裂解机制，该条件下发生了较高比例的5'-VP末端链断裂，产生占比约19.39%的N-1+磷酸基团脱落产物（质谱观测值m/z -317）。因此，POM-VP Oligo脱保护需避免强碱预处理步骤。

02纯氨水脱保护引起的丙烯腈加合物（+53）

为了避免N-1降解副产物，若省略哌啶预处理而直接使用氨水一步法脱保护，虽然保留了末端结构，但会造成丙烯腈加合物增加。LC-MS分析显示，单独使用28-30%氨水在35°C孵育20小时，粗品中会产生约9.89%的丙烯腈加合物。这是因为磷酸骨架保护基（氰乙基）在碱性条件下释放出的丙烯腈具有较强亲电性，可共价加成到尿嘧啶/胸腺嘧啶的N1位置。

图3：丙烯腈N1加合物与嘧啶C6胺加合物的化学结构示意图

图4：单独使用氨水脱保护产生9.89%丙烯腈加合物

在ON-1模型的纯氨水（28-30% NH4OH，35°C，20h）脱保护实验中，Deconvoluted MS谱图清晰观测到主峰右侧存在高强度杂质峰。分子量较主峰增加53，对应丙烯腈加成至嘧啶碱基N1位置的结构，占比高达9.89%。这说明纯氨水体系缺乏足够的丙烯腈清除能力。

03强亲核试剂引发的胺类加合物杂质

传统固相合成工艺中，常在氨水中加入甲胺（Methylamine，如AMA试剂）等强亲核试剂来捕获并清除丙烯腈。但在VP修饰体系中，强亲核胺可能引发新的副反应：胺类试剂会攻击尿嘧啶，尤其是2'-F修饰嘧啶碱基的C6位置，形成共价加合物。实验数据显示，使用40%甲胺水溶液在60°C处理15分钟，甲胺加合物比例可高达19.23%；在3%甲胺/氨水体系中，仍可检出3.83%的甲胺加合物。

图5：3%甲胺/氨水体系下产生3.83%甲胺加合杂质

ON-2在3%甲胺/氨水条件下处理后，LC-MS粗品谱图仍检出3.83%的甲胺加合物。强亲核性的甲胺会攻击2'-F-U和2'-OMe-U的C6位置形成极性更大的加成产物，这说明甲胺并非POM-VP体系的理想清除剂。

二、最优脱保护试剂：3% DEA/氨水

为解决VP-Oligo脱保护过程中的杂质难题，研究人员在28-30%（w/v）氨水中，分别添加3%（v/v）的多种胺类作为丙烯腈清除剂进行平行测试，包括甲胺、正丁胺、正丙胺和二乙胺（Diethylamine, DEA）。筛选结果表明，二乙胺（DEA）在综合性能与副反应平衡方面表现更优。

图6：3% DEA/氨水体系（35°C，20h）得到较纯净的LC-MS谱图

ON-2在3% DEA / 28-30% NH4OH（35°C，20h）条件下脱保护后，粗品LC-MS显示高纯度单一主峰，丙烯腈加合、胺加合与N-1裂解三类杂质均在1.0%检出限以下（n.d.）。

三、从模型到工业应用：多序列、多修饰与放大验证

成熟的脱保护条件不仅需要在模型序列上成立，更需要验证其在接近真实siRNA药物序列、复杂化学修饰及更大合成规模下的稳健性。研究人员将3% DEA / 28-30%氨水条件拓展应用到多条5'-POM-VP 23-mer反义链序列（ON-3至ON-7），这些序列覆盖2'-OMe、2'-F氟代修饰以及硫代磷酸酯（PS）骨架修饰，并将固相合成规模从10μmol逐步放大至100μmol及320μmol。

图7：3% DEA/氨水条件在多序列、多种修饰及10-320μmol规模下的验证结果

在ON-3至ON-7等测试序列及10-320μmol放大规模中，采用3% DEA/NH4OH条件（35°C 20h或60°C 5h）脱保护后，丙烯腈加合物与胺加合物均未检出（n.d.<1.0%），粗品纯度良好。这为从小试研发到放大生产提供了文献与实验依据。

四、脱保护解决方案与完整技术包建议

五、关于芜湖华仁

芜湖华仁2006年成立，是国内较早开展核苷相关产品研产销的企业之一，在核苷、核苷酸相关产品领域有着近20年的技术积淀和产品服务经验。2022年加入杭州中美华东后，公司导入中美华东药品质量管理理念及现有质量管理体系，并持续开展生产、研发、质量、EHS等全方位体系改造，已获得ISO9001、ISO14001和ISO45001体系认证，以及Ecovadis铜牌认证。

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