从EMA审评报告看THA8怎么接上Oligo？

导语：公开文献同时验证了固相亚磷酰胺路线和液相后偶联路线；但从几款已上市产品的 EMA 申报资料来看，商业化产品更明确地指向另一条路径：先完成并纯化氨基己基修饰的 oligo，再与羧酸型 THA8 进行后偶联。本文围绕两种方法及上市产品监管资料进行梳理。

01 一个看似简单、其实容易混淆的问题

在 Ionis 的 LICA 平台中，三触角 GalNAc 配体通过 THA 骨架连接到寡核苷酸 5′ 端。围绕这一步，通常有两种理解：一种是把完整的 THA 做成亚磷酰胺单体，作为 oligo 固相合成的最后一次偶联；另一种是先制备带 C6-Linker 的 oligo，裂解并纯化后，再通过酰胺化把 THA8 接上去。

公开文献告诉我们“两条路线都能做”；而上市申报资料回答的则是更关键的问题：最终商业化产品实际选择了哪一条。

02 文献解读：两条路线均有依据

围绕 THA-GalNAc 与 oligo 的连接，公开资料主要有两种方案：其一，把完整 THA8 制成亚磷酰胺单体，在固相合成末端直接偶联；其二，先制备 C6-Linker-oligo，裂解、纯化后，再与 THA8 进行液相酰胺化。

CN109661233A：固相大单体路线

该专利保护一种将 THA8 以单体形式缀合到 oligo 上的新制备方法。不过，IONIS 并未在中国维持该专利，目前该中国专利已视为撤回状态；其对应美国专利仍有授权。

在该专利实施例中，20-mer ISIS-681257 在树脂上组装完成后，以 THA-GalNAc phosphoramidite 进行循环偶联；后续实施例进一步考察当量、温度与循环时间，并报告了较高的偶联效率。这说明固相大单体路线在技术上可行。

Molecules 2017：液相与固相路线正面对比

Ionis 曾同时比较液相 PFP 活性酯路线和固相亚磷酰胺路线。液相路线偶联效率超过 99%，最终纯度略高；固相路线工序更少，但偶联效率约 90%，且需要关注大单体带来的杂质控制问题。

文章还提到，液相路线可靠、选择性高，并已用于多公斤级缀合药物原料生产。但该文献并未公开该“多公斤级药物”的具体品种，因此它是强烈的产业化线索，却还不是某个上市产品的直接路线证明。

US11414657：固相路线用于 crRNA

该专利先用 THA8 活性酯与 6-氨基己醇反应，再进一步上磷制备 GalNAc-THA-C6 phosphoramidite，最终在树脂上接入 crRNA。它再次证明固相大单体路线可行，但仍不能代表上市产品的实际商业工艺。

03 三款上市产品 EMA 公开审评文件解读

EMA 公开审评文件对 Eplontersen、Olezarsen 和 Donidalorsen 的原料药工艺进行了披露，三者结论高度一致：商业工艺均指向“先制备并纯化氨基己基修饰的 oligo，再与 THA8 后偶联”。

示例解读：Donidalorsen 的八个单元操作

用于遗传性血管性水肿的 Donidalorsen 提供了目前较完整的公开工艺证据。EMA 将其商业原料药制造过程拆分为八个单元操作：固相合成，随后裂解和脱保护；反相色谱；脱三苯甲基保护；缀合 THA8；强阴离子交换色谱；超滤/透析；薄膜蒸发；冻干。

由此可见，GalNAc 缀合明确发生在 oligo 从树脂裂解、脱保护并完成第一次 RP 纯化之后。起始物料清单同样包括核苷亚磷酰胺、MMT-C6-amine-linker 亚磷酰胺和 THA8，分别对应 oligo 单体、5′ 连接臂和三触角 GalNAc 配体。

文件还提到，固相合成获得的是 “MMT-on aminohexyl intermediate”，并通过实验确认 THA8 特异性连接到 aminohexyl linker（C6-amine-linker），而不是核碱基氨基。EMA 进一步说明，Donidalorsen 的商业工艺与临床开发同步建立，整个开发历史中合成方法没有显著改变，临床批次均采用相同的步骤顺序。

04 对工艺开发与原料选择的启示

基于上市产品监管资料来看，商业工艺的关键物料包括：高质量 MMT-C6-amine-linker 亚磷酰胺、符合申报控制要求的 THA8 羧酸，以及与后偶联相关的活化、纯化和杂质控制能力。

尽管当前含 THA8 结构的 ASO 上市药物普遍采用“先制备 C6-Linker-oligo，后与 THA8 偶联”的成熟路径，但对于后续仿制药开发而言，工艺路线的抉择仍需跳出单一思维。偶联效率、配体利用率、树脂负载能力、下游纯化难度、杂质清除效能、生产设备适配性以及潜在知识产权壁垒，都是需要综合评估的关键因素。

关于芜湖华仁

芜湖华仁 2006 年成立，是国内较早开展核苷相关产品研产销的企业之一，在核苷、核苷酸相关产品领域有近 20 年的技术积淀和产品服务经验。2022 年加入杭州中美华东后，公司导入中美华东药品质量管理理念及现有质量管理体系，并持续推进生产、研发、质量、EHS 等全方位体系升级。

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参考文献

[1] CN 109661233 A，缀合低聚化合物的方法。

[2] Cedillo I. et al. Synthesis of 5′-GalNAc-Conjugated Oligonucleotides: A Comparison of Solid and Solution-Phase Conjugation Strategies. Molecules, 2017, 22, 1356A.

[3] US 11414657 B2, Modified CRISPR RNA and Modified Single CRISPR RNA and Uses Thereof.

[4] https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/wainzua-epar-public-assessment-report_en.pdf

[5] https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/tryngolza-epar-public-assessment-report_en.pdf

[6] https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/dawnzera-epar-public-assessment-report_en.pdf

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